首先，DNA成為單鏈是引物可以順利結合的前提，如果沒有經過充分的解旋，擴增效率肯定會大受影響（等溫擴增不在此列）。比如擴增cDNA變性大概10sec就夠，擴增質粒則往往要30sec及以上。

其次，熒光探針需要先于引物結合到模板上，不論是水解探針還是蝎形探針。否則就會出現變性好的單鏈DNA在引物和酶的作用下都已經補齊了另一條鏈了，探針還在一邊傻傻的說：“我沒上車啊~"

最后，常規的qPCR擴增片段一般在200bp左右，延伸時間設定30-45sec也基本夠用。至于說延伸溫度，多會把退火和延伸合并為一步，溫度采用60℃。但是有些反應，因為整體的反應優化不太理想或者是反應自身的一些固有限制，兩步法擴增的效果不夠好，此時可以使用三步法擴增，提高產物積累。采用三步法擴增時有個值得推敲的點，信號收集該是在退火階段還是延伸階段？染料法、水解探針、蝎形探針的答案并不一樣，可自行推導一番然后理論聯系實際驗證一下。