熒光定量PCR(qPCR)是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，它將在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
 

　　熒光定量PCR的測定步驟：
 

　　1.實驗準備：
 

　　-儀器檢查：打開設(shè)備電源，檢查是否正常啟動；查看觸摸屏、電腦連接等是否正常。
 

　　-樣品準備：確保樣品的質(zhì)量良好，無雜質(zhì)和污染，并根據(jù)實驗需要適當稀釋樣品。
 

　　-引物設(shè)計：合理設(shè)計引物序列，確保其特異性和互補性，避免引物間的二聚體或非特異性擴增。
 

　　-反應體系準備：根據(jù)實驗需要準備好反應體系，包括引物、模板DNA、熒光標記的探針和PCR反應緩沖液等。
 

　　2.設(shè)置PCR反應：
 

　　-選擇適當?shù)臒嵫h(huán)參數(shù)：包括初始變性溫度和時間、退火溫度和時間以及延伸溫度和時間。這些參數(shù)應根據(jù)具體的引物和模板特性進行優(yōu)化。
 

　　-將反應體系加入PCR管或板中：并確保密封良好以避免污染和蒸發(fā)。
 

　　-將PCR管或板放入PCR儀中：并關(guān)閉蓋子以確保溫度均勻分布。
 

　　3.開始PCR反應：
 

　　-啟動PCR程序：按照設(shè)定的熱循環(huán)參數(shù)進行PCR反應。
 

　　-實時監(jiān)測熒光信號：在每個循環(huán)結(jié)束時收集熒光信號強度。
 

　　4.數(shù)據(jù)分析：
 

　　-生成擴增曲線：通過將熒光強度與循環(huán)數(shù)作圖生成擴增曲線。
 

　　-確定閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)：Ct值是指擴增過程中熒光信號達到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)。
 

　　-計算相對表達量或絕對拷貝數(shù)：使用標準曲線法或比較\(2^{-\Delta\Delta Ct}\)法等方法對目標基因進行定量分析。